基因工程是高中生物核心知识点。基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

　　基因工程

　　(DNA重组技术)：体外、定向、分子水平

　　基本工具：限制性核酸内切酶(限制酶)来自原核细胞，识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

　　DNA连接酶： E·coliDNA连接酶(只黏性末端)

　　T4DNA连接酶(黏、平末端也可但效率低)

　　载体：质粒、入菌体的衍生物、动植物病毒

　　条件：①能在宿主细胞内稳定存在复制表达

　　②一种或多种限制酶切点

　　③标记基因(抗生素抗性基因、荧光基因)

　　基本操作程序：

　　1、目的基因的获取：(人工合成、体内提取)

　　①从基因文库获取

　　②PCR技术扩增目的基因：模板、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)、原料&能量(dXTP)、引物(过量)

　　五物混合，加热至90～95℃，DNA解旋，冷却到55～60℃，引物与互补DNA链结合，加热至70～75℃，

　　Taq酶从引物起始互补链的合成

　　③人工化学合成：基因比较小，核苷酸序列已知

　　2、基因表达载体的构建：(基因工程的核心)

　　启动子：DNA片段，基因的首端，RNA聚合酶识别和结合的部位

　　目的基因

　　终止子：DNA片段 ，基因的尾端

　　标记基因：鉴别受体细胞中是否含有外源基因，从而将含有外源基因的细胞筛选出来。

　　(复制原点：仅自我复制的需要，整合到宿主染色体上再表达的不需要)

　　3、将目的基因导入受体细胞：

　　转化：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

　　(1)导入植物细胞(体细胞、受精卵)

　　①农杆菌转化法(双子叶植物、裸子植物)

　　受损，伤口细胞分泌酚类化合物，吸引农杆菌移向，Ti质粒上T-DNA(上插目的基因)转移至受体细胞整合到受体细胞染色体上

　　②基因枪法(单子叶植物)

　　③花粉管通道法

　　(2)导入动物细胞(受精卵)显微注射技术

　　(3)导入微生物细胞

　　优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、对人体无害(大肠杆菌)

　　步骤：Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子

　　4、目的基因的检测与鉴定：

　　①DNA分子杂交技术：转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因(目的基因是否进入原核细胞)

　　转基因生物的染色体DNA(原核质粒)+有同位素标记的目的基因

　　②RNA分子杂交技术：目的基因是否转录出了mRNA 转基因生物的mRNA+有同位素标记的目的基因

　　③抗原-抗体杂交：目的基因是否翻译成蛋白质 转基因生物的蛋白质+相应的抗体

　　④个体生物学水平的鉴定：抗虫抗病的接种实验

　　蛋白质工程

　　(自然界不存在的蛋白质)

　　预期蛋白质功能，设计蛋白质结构，推测氨基酸序列，找对应的脱氧核苷酸序列，人工合成基因，基因工程，蛋白质产品

　　细胞工程：

　　(一)植物细胞工程：

　　1、植物组织培养技术：

　　(1)原理：植物体细胞的全能性

　　(2)过程：离体的植物器官、组织或细胞，脱分化(避光)，愈伤组织(未分化，薄壁细胞)，再分化，根芽，细胞分裂分化，植株

　　(3)条件：无菌(防止微生物污染)

　　营养(无机盐、有机物、水)

　　激素(生长素、细胞分裂素，=1诱导脱分化，>1生根，<1生芽，激素杠杆)

　　离体

　　2、植物体细胞杂交技术：克服生殖隔离(不同生物远缘杂交不亲和的障碍)

　　(二)动物细胞工程：

　　1、动物细胞培养：

　　(1)原理：一些动物细胞在体外可生长增殖

　　(2)过程：

　　动物组织块，剪碎，胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，分散成单个细胞，制成细胞悬液

　　原代培养：转入培养瓶，细胞贴壁(培养瓶内壁光滑无毒易于贴附)，细胞有丝分裂，接触抑制

　　胰蛋白酶处理

　　分瓶继续传代培养(10代以内以保持正常的二倍体核型，50代以上癌细胞)

　　(3)条件：

　　无菌无毒的环境：用具无菌处理;培养液中加抗生素;定期更换培养液(清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害)

　　营养：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血清血浆

　　温度和pH：动物体温(哺乳36+ -0.5℃)，pH=7.2-7.4

　　气体环境：95%空气+5%CO2(维持培养液pH)

　　2、动物体细胞核移植技术(克隆动物)胚胎细胞核移植(易) 移入去核卵母细胞

　　3、动物细胞融合(细胞杂交)：除物理化学法外，还可用灭活的病毒诱导

　　4、杂交瘤技术(生产单克隆抗体)

　　(1)传统方法：向动物体内反复注射某种抗原，产生抗体后从血清中分离，抗体产量低纯度低特异性差

　　(2)单克隆抗体优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备

　　胚胎工程：

　　早期胚胎或配子水平

　　(一)体内受精和早期胚胎发育：

　　1、精子的发生：睾丸的曲细精管内，初情期开始

　　变形：细胞核—精子头，高尔基体—顶体，中心体—尾，线粒体—尾的基部的线粒体鞘，

　　其他物质—原生质滴向后脱落

　　2、卵子的发生：卵巢及输卵管

　　胎儿性别分化后：卵原细胞有丝分裂，并变成初级卵母细胞，被卵泡细胞包围形成卵泡

　　卵泡的形成和在卵巢内的储备在出生前(胎儿时期完成)

　　初情期后：初级卵母细胞——次级卵母细胞和第一极体——减二中期停——卵子、极体

　　马狗排卵 猪牛羊排卵 受精

　　卵子是否受精的标志：卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体

　　3、受精：输卵管内完成

　　(1)精子获能

　　(2)卵子的准备：达到减数第二次分裂中期

　　(3)受精：

　　顶体反应，释放顶体内酶，溶解卵丘细胞之间的物质，穿越放射冠、透明带，(精子触及卵黄膜的瞬间)透明带反应，精子外膜和卵黄膜相互融合(标志着精子入卵)，卵黄膜的封闭作用&精子尾部脱离形成雄原核，卵子减二完成，排出第二极体，形成雌原核，比雄原核小，核融合(标志受精卵的产生)

　　防止多精入卵：透明带反应 卵黄膜的封闭作用

　　4、胚胎发育：卵裂期(透明带内，有丝分裂，胚胎的总体体积并不增加，或略有减小)

　　(1)桑椹胚：细胞数目32个，全能细胞

　　(2)囊 胚：开始出现分化，内细胞团(胎儿);囊胚腔;滋养层细胞(胎膜胎盘)

　　孵化：透明带破裂，胚胎伸展出来

　　(3)原肠胚：内细胞团—外胚层、内胚层、中胚层，原肠腔

　　(二)体外：

　　1、体外受精：

　　(1)卵母细胞的采集：实验动物、猪、羊—促性腺激素处理超数排卵，输卵管中冲取

　　大牛：屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞;活体动物的卵巢中吸取卵母细胞

　　人工培养至减二中期

　　(2)精子的采集和获能：假阴道法、手握法、电刺激法

　　获能处理：培养法(人工配制的获能液);化学诱导法(一定浓度的肝素或钙离子载体溶液)

　　(3)受精：获能溶液或专用的受精溶液

　　2、胚胎的早期培养：

　　无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清

　　向受体移植或冷冻保存

　　3、胚胎移植：

　　(1)意义：充分发挥雌性优良个体的繁殖能力;大大缩短了供体本身的繁殖周期;良种畜群迅速扩大，加速了育种工作和品种改良;不受时间地域限制，节省购买种畜费用;胚胎冷冻保存品种资源和濒危物种

　　(2)基本程序：

　　①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。

　　②同种优秀公牛配种或人工授精。

　　③把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(冲卵)，胚胎进行质量检查，向受体移植或放入液氮中保存。

　　④对受体母牛进行是否妊娠的检查。

　　(3)生理学基础：

　　①同期发情处理，为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。

　　②早期胚胎在一定时间内处于游离状态，不与母体子宫建立组织上联系，可以胚胎收集。

　　③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应，胚胎可以在受体的存活。

　　④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但遗传特性在孕育过程中不受影响。

　　4、胚胎分割：

　　实体显微镜、显微操作仪

　　发育良好，形态正常的桑椹胚或囊胚(内细胞团均等分割)

　　5、胚胎干细胞(ES或EK细胞):

　　来源于早期胚胎或原始性腺

　　具有胚胎细胞的特性：体积小，细胞核大，核仁明显;具有发育的全能性

　　体外诱导分化：(1)治疗人类的某些顽症

　　(2)培育出人造组织器官，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。

　　(3)饲养层细胞上或添加抑制剂的培养液中不分化，加入分化诱导因子(牛黄酸、丁酰环腺苷酸)，是在体外条件下研究细胞分化的理想材料。

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